PKLR 基因中新的纯合错义变异 p.D339N 与巴基斯坦家庭中的丙酮酸激酶缺乏症相关：病例报告
抽象的
丙酮酸激酶缺乏症是一种极为罕见的常染色体隐性孟德尔遗传病，由 PKLR 基因的双等位基因致病变异引起。该病的主要特征是慢性非球形红细胞性溶血性贫血，但也可能出现脾肿大、肝肿大、苍白、疲劳、铁过载、呼吸急促、高胆红素血症和胆结石等其他症状。
我们在此介绍了巴基斯坦西北部一个近亲家族中 PKLR 基因的一种新型遗传缺陷，该缺陷与丙酮酸激酶缺乏症表型相关。该家族包括三名患病个体，他们均出生于近亲父母。先证者是一名 13 岁的普什图族女性，自出生以来就患有慢性非自身免疫性溶血性贫血，血红蛋白（7.6 g/dL）和丙酮酸激酶（12.4 U/g Hb）水平极低，脾肿大和肝肿大。骨髓抽吸物显示髓系与红系比例明显下降，红系元素增生导致骨髓颗粒细胞增多。对先证者基因组 DNA 的分子表征发现 PKLR 基因外显子 7 中存在可能致病的纯合错义变异 p.[D339N]。深入的硅片分析和家族共遗传表明 p.[D339N] 可能是该家族丙酮酸激酶缺乏症的病因。需要进一步的体外或体内研究来验证 p.[D339N] 对蛋白质结构和/或稳定性的影响，并确定其在疾病病理生理学中的作用。
总之，这些发现表明 PKLR 基因中的新遗传缺陷可能是导致丙酮酸激酶缺乏的原因，从而进一步扩大了这种罕见孟德尔疾病的突变前景。
背景
丙酮酸激酶缺乏症 (PKD) 主要以慢性非球形红细胞性溶血性贫血 (CNSHA) 为特征，但也可能出现脾肿大、肝肿大、苍白、疲劳、铁超负荷、气喘、高胆红素血症和胆结石等其他症状，表明 PKD 在患者中表现出相当大的临床差异性 [1]。症状可能从很少或没有临床指征到更严重和危及生命的贫血，尤其是在儿童时期 [1]。PKD 影响所有种族的人，然而，各国的患病率并不一致。它似乎影响每百万名西方血统的人中的 51 人 [2,3]。该病因 PKLR 基因（丙酮酸激酶，肝脏和红细胞同工酶）的遗传缺陷引起，并以常染色体隐性遗传 [4]。 PKLR基因位于1q21染色体上，编码一种叫做丙酮酸激酶（PK）的糖酵解酶，对葡萄糖代谢（糖酵解）、三磷酸腺苷（ATP）的产生和细胞的能量平衡至关重要[5]。
迄今为止，已报道 PKLR 基因中存在 300 多种致病或可能致病的变异，主要是错义替换 [6]。正确诊断 PKD 需要识别 PKLR 基因中的病理变化，并随后确认其对 PK 酶活性的影响。这一点很重要，因为 PKLR 基因中的所有序列变异不一定都是致病的，正如在一些 PKLR 基因纯合或复合杂合变化但 PK 活性正常的患者中观察到的那样 [7,8]。相反，一些 PKLR 变异被发现对小鼠和人类有益，因为它们可以预防疟疾感染 [9]。因此，在疟疾流行的国家，例如巴基斯坦和撒哈拉以南非洲，PKLR 基因一直承受着强大的选择压力 [10,11]。
目前，尚无获批的治疗方案可用于纠正 PKD [12]。现有的 PK 缺乏症治疗主要包括支持性治疗，如输注红细胞 (RBC)、铁螯合疗法和/或脾切除术 [5]。然而，这些支持性治疗具有许多固有风险，特别是肺动脉高压、血栓形成、铁负荷、骨质减少、胆结石和髓外造血 [13,14,15]。据我们所知，迄今为止尚无任何研究记录巴基斯坦 PK 缺乏症的分子原因。在本次调查中，我们报告了 PKLR 基因中的一种新型分子缺陷，可能导致巴基斯坦西北部一个近亲家庭出现 PK 缺乏症。
方法
本研究是在获得曼塞赫拉哈扎拉大学机构审查委员会的正式授权（批准号 F.NO:185/HU/Zool/2021/182）和家庭监护人的书面知情同意批准后启动的。临床数据从现有的医疗记录中提取，同时使用 Pedigree Chart Designer 软件（CeGaT GmbH，德国图宾根）以电子方式绘制家谱。使用 Oragene DNA 收集试剂盒（Genotek，加拿大渥太华）从该家庭的六名参与人员那里获取唾液样本。参与者包括先证者、先证者的母亲、祖父母、叔叔和他的妻子。按照 prepIT.L2P 手册中提到的乙醇沉淀方案从唾液样本中提取 DNA。分别使用分光光度计和 1% 琼脂糖凝胶对 DNA 进行定量和定性评估。为了 PCR 扩增 PKLR 基因 (NM_000298.6; NP_000289.1) 的编码区和外显子-内含子边界，使用 Primer3web (版本 4.1) [16] 设计了总共八个外显子特异性引物对。引物序列和 PCR 循环分别显示在附加文件 1：表 S1 和 S2 中。简而言之，PCR 包括以下步骤：模板 DNA 在 95 °C 下初始变性 5 分钟，然后进行 35 个 PCR 循环，每个循环在 95 °C 下持续 30 秒（变性步骤），57 °C 下持续 30 秒（引物退火步骤），72 °C 下持续 30 秒（延伸步骤），以及在 72 °C 下进行最终延伸 5 分钟。在使用商业设备对产品进行 Sanger 测序之前，先使用 ExoSAP-IT 试剂（目录号 # 78200，美国赛默飞世尔科技）纯化 PCR 产物。
病例介绍
我们从临床和遗传两个角度描述了一个患有丙酮酸激酶缺乏症 (PKD) 的巴基斯坦近亲结婚家庭。该家庭属于居住在白沙瓦市的普什图族，由三名患者组成；先证者 (III.6)、她的兄弟 (III.4) 和一个堂兄弟 (III.1)，他们均出生于近亲结婚的父母 (图 1)。但仅对先证者进行了基因检测。先证者现年 13 岁，为近亲结婚的夫妇足月出生。临床检查显示，先证者出生时患有慢性、最有可能的先天性非自身免疫性溶血性贫血，因此建议输血。从她 22 天大开始定期输血，频率为每月一次至每 3 个月一次。除输血外，建议每日口服叶酸 1 毫克，共 30 天，以稳定患者的血红蛋白水平。患儿腋温 36.1 ℃，外周脉搏 114 次/分，呼吸频率 24 次/分，收缩压 94 毫米汞柱，舒张压 500 毫米汞柱，血氧饱和度 99%，身高 94.3 厘米，体重 13.4 公斤，体重指数 15.1 公斤/平方米，体表面积 0.59 平方米。尽管患儿的父母都相对较高，但患儿的身高和体重仍保持在第三百分位，可能表明儿童期缺乏预期的正常生理发育。患儿的血型为 AB 阴性。免疫接种已及时完成，临床检查未发现已知过敏。超声心动图 (echo) 无异常。肌肉骨骼、神经、淋巴和外皮系统检查未发现不良反应。腹部检查发现肝肿大（可触及，右肋缘下 2.6 厘米，光滑，无压痛），脾肿大（可触及，左肋缘下 2 厘米，边缘光滑，无压痛；脾脏大小 8.8 厘米）。骨髓穿刺物显示髓系与红系 (M/E) 比率明显下降，由于红系元素增生且成熟度正常，骨髓颗粒细胞明显增多。但骨髓成熟正常，巨核细胞数也在正常范围内，因此排除了红细胞再生障碍、骨髓增生异常综合征或先天性红细胞生成性贫血 (CDA) 的证据。阵发性睡眠性血红蛋白尿 (PNH) 筛查也为阴性。血液血红蛋白 (Hb) 和丙酮酸激酶 (PK) 水平的测量值极低，分别为 7.6 g/dL 和 12.4 U/g Hb（表 1）。根据临床发现，最终诊断为丙酮酸激酶缺乏症 (PKD)。
图 1
巴基斯坦分离PKLR突变家族的谱系。实心符号表示患者，空白符号表示健康个体。带有中心点的符号表示肯定携带者。M = 突变；+ = 野生型等位基因。谱系中的先证者用小箭头表示
Sanger 测序表明，PKLR 基因外显子 7 中存在可能致病的纯合错义变异 (c.1015G > A)，导致 PK 蛋白中发生单个氨基酸取代 p.[D339N]。变异 p.[D339N] 与所研究家族中的 PKD 表型共分离（图 1）。例如，该变异在先证者中以纯合状态存在，而临床上未受到影响的家族成员中均未携带纯合状态的变异。在参与本研究的五名未受到影响的家族成员中，四人为该变异的杂合子，一人为野生型等位基因的纯合子。据我们所知，变异 c.1015G > A 从未与 PKD 表型相关联，之前也未在 ClinVar 或人类基因突变数据库 (HGMD) 中报道过。该变异在 gnomAD 数据库中以极低的次要等位基因频率 (MAF 0.00001592) 存在；然而，该等位基因不以纯合状态存在。Existingin silicotools 和美国医学遗传学和基因组学学院 (ACMG) 将该变异归类为“可能致病”（表 1）。PK 直系同源物的多重序列比对表明 Asp339 残基在脊椎动物物种间具有最高的保守性（图 2），从而反映了 Asp339 残基对 PK 活性的重要性。为了找出这种突变对蛋白质 3D 结构的影响，我们使用在线方法模拟了野生和突变蛋白质结构 [17]。同样，我们使用 MOE 软件进行对接以评估蛋白质-配体相互作用 [18]。这些计算分析表明，野生型 PK 通过三个残基与磷酸烯醇式丙酮酸相互作用，包括 Arg116、Glu316 和 Asp339。然而，突变蛋白（p.[D339N]）失去了与磷酸烯醇丙酮酸的正常相互作用，并通过 Arg216 和 Glu34

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