一名未接受过抗逆转录病毒药物治疗的人类免疫缺陷病毒 1 感染女性，出现持续性无反应性前病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应：病例报告
抽象的
人类免疫缺陷病毒的复制涉及一个必需步骤，即将病毒核糖核酸基因组逆转录为双链脱氧核糖核酸，然后将脱氧核糖核酸整合到人类染色质中以形成原病毒脱氧核糖核酸。这种原病毒人类免疫缺陷病毒脱氧核糖核酸是诊断急性感染、母婴传播和确认不确定血清学反应的关键标志物。我们描述了一名人类免疫缺陷病毒阳性女性的病例，该女性未接受过抗逆转录病毒治疗，其人类免疫缺陷病毒原病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应持续呈阴性。据我们所知，这是首次在非洲描述这种观察结果。
一名居住在喀麦隆的 28 岁加蓬女性要求我们实验室进行人类免疫缺陷病毒诊断。6 个月前，她在加蓬度假期间有过一次无保护的异性性接触。要求进行人类免疫缺陷病毒检测是因为接触事件后产生了担忧。人类免疫缺陷病毒血清学检查结果不明确，因此进行了确认试验（包括人类免疫缺陷病毒前病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应）。除了人类免疫缺陷病毒前病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应持续呈阴性外，进行的所有其他聚合酶链反应均为阳性。脱氧核糖核酸序列已提交至 GenBank 数据库，登录号分别为：蛋白酶、逆转录酶和 gp41 基因的 KC626022、KC626023 和 KC626024。
确诊感染人类免疫缺陷病毒的人的人类免疫缺陷病毒前病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应持续呈阴性，在人类免疫缺陷病毒诊断领域具有重要意义。这可能凸显出人类免疫缺陷病毒前病毒脱氧核糖核酸聚合酶链反应存在假阴性的情况，尤其是在人类免疫缺陷病毒的遗传变异性很高的情况下。此类假阴性检测在识别急性感染、母婴传播和确认不确定的血清学反应方面带来的挑战令人生畏。因此，这些数据将非常宝贵，尤其是对非洲的临床医生来说，因为那里有非 B 型人类免疫缺陷病毒的传播。
介绍
前病毒人类免疫缺陷病毒 (HIV) 脱氧核糖核酸 (DNA) 是诊断急性感染、解决不确定的 HIV 血清学检测以及诊断 HIV 血清阳性母亲所生新生儿的有用标记。在婴儿期和 18 个月大时，由于母亲通过胎盘传播的 HIV 抗体使无法进行抗体检测以进行诊断。在喀麦隆，前病毒 HIV DNA 聚合酶链反应 (PCR) 在诊断早期婴儿感染方面的重要性已得到证实 [1]。喀麦隆血清学不确定病例很大程度上归因于观察到的假阳性反应数量增加。我们实验室的 HIV 不确定病例定义为前两次酶联免疫吸附试验 (EIA) 之间或 EIA 和 HIV 组鉴别血清分型之间结果不一致的样本。在我们的实验室中，使用原病毒 DNA PCR（Generic HIV DNA Cell，Biocentric，法国班多尔）对血清学不确定病例进行 HIV 确认是一种常规做法。该技术已用于确认接受抗逆转录病毒 (ARV) 治疗且在 18 个月后显示 HIV 不确定或阴性血清学特征的儿童的 HIV 感染情况 [2]。
在本病例报告中，我们描述了一名血清学不确定的 HIV 阳性女性，其前病毒 DNA PCR 反复呈阴性，但使用替代检测方法确认了阳性。在最近使用前病毒 DNA PCR 的地区，尤其是用于新生儿 HIV 诊断和 HIV 血清学不确定病例确认的地区，这种假阴性 HIV 前病毒 DNA 的含义对公共卫生至关重要。
病例介绍
一名居住在喀麦隆的 28 岁加蓬女性在我们的实验室要求进行 HIV 诊断。她报告称 6 个月前在加蓬度假期间曾有过一次无保护的异性性接触。重复进行之前描述的血清学分析 [3]，略作修改。简而言之，初始血清学分析包括两种第四代 EIA（Murex Ag-Ab 组合 Abbott 和 Genscreen ULTRA Ag-Ab Bio-Rad，法国 Marnes-la-Coquette），然后进行内部血清分型试验以区分 HIV 组 [3,4]。在收集的第一个样本（D0）中，我们观察到所使用的不同筛选试验之间存在不一致的血清学结果。2 周后收集了新鲜样本（D15），获得了相似的血清学结果。因此，对 D15 进行了进一步的血清学和分子测试，以确认该女性的 HIV 状态。在第一个样本采集 6 周后收集了用于确认这些血清学和分子测试的最终样本（D49）。分子检测利用了从样本中提取的以下遗传物质：根据制造商的建议，使用 QIAamp® Viral RNA 迷你试剂盒（Qiagen，法国库尔塔博夫）从 200μL 血浆中提取核糖核酸 (RNA)，使用 QIAamp® DNA 迷你试剂盒（Qiagen）从 200μL 白膜中提取 DNA。总共进行了以下补充测试：
HIV 蛋白质印迹法（Bio-Rad）。
HIV-1 组 M RNA 病毒载量（Biocentric），针对 HIV 的长末端重复 (LTR) 基因 [5]。
针对 HIV 的 LTR 基因的 HIV-1 前病毒 M 组 DNA PCR（Biocentric）[6]。
一种“内部”原病毒 HIV-1 O 组 PCR，用于检测原病毒 DNA（LTR 基因）。
HIV-1 O 组（整合酶基因）的“内部”血浆 RNA 病毒载量。
Heyndrickx 及其同事描述称，在 HIV 整合酶基因的 RNA 逆转录步骤后，进行“O 组和 M 组特异性 PCR”[7]。
对HIV-1 M组以下基因进行特异性PCR：蛋白酶、逆转录酶 [8] 和gp41 [9]。对与我们之前描述的相同区域进行类似的HIV-1 O组特异性PCR [3]。
如表 1 所示，对 D15 采集的样本进行蛋白质印迹分析，结果显示存在以下肽：gp160、痕量 gp110/120 和 gp41、p68、p55、p40、p25 和 p18。使用 FACSCount™ (Becton Dickinson) 进行的 CD4 T 淋巴细胞计数在 D49 时为 893 个细胞/mm3。HIV-1 M 组 RNA 病毒载量在 D15 时为 3.9 log 拷贝/mL，在 D49 时为 3.3 log 拷贝/mL。相比之下，在 D15 和 D49 时（每个时间点连续重复三次），前病毒 HIV-1 DNA M 组和 O 组（“内部”）PCR 重复检测不到。用于扩增 HIV-1 M 组整合酶基因的非特异性引物（表 2）可检测到。此外，实时 (RT) RNA PCR 扩增了 HIV-1 M 组的逆转录酶、蛋白酶和 gp41 基因，但没有扩增 HIV-1 O 组的逆转录酶、蛋白酶和 gp41 基因，因此表明感染了 HIV-1 M 组。用于这些测试的引物列于表 2 中。对扩增产物的部分测序以及逆转录酶、蛋白酶和 gp41 基因的系统发育分析进一步表明感染了 HIV-1 M 组 A 亚型病毒。这些基因的 DNA 序列已提交到 GenBank 数据库，登录号如下：蛋白酶 - KC626022、逆转录酶 - KC626023 和 gp41 - KC626024。除上述分析外，按照法国国家肝炎和病毒研究所 2012 年算法 [10]，我们未发现任何可能导致对非核苷酸逆转录酶抑制剂和核苷酸逆转录酶抑制剂类药物产生耐药性的主要或次要氨基酸突变。然而，蛋白酶基因的氨基酸分析显示，第 63 个密码子 (L63P) 存在氨基酸突变，这与洛匹那韦耐药位点的多态性有关。蛋白酶基因中还存在 H69K 和 L89M，这使得 B 亚型毒株可能对替拉那韦产生耐药性，但非 B 亚型的数据不足。这些结果表明，患者体内的这种病毒株可能对喀麦隆目前使用的大多数抗逆转录病毒药物敏感。
讨论
据我们所知，仅详细描述了两例 HIV-1 前病毒 DNA PCR 假阴性结果。第一例发生在试图诊断美国一名 8 个月大的苏丹裔女婴的 HIV 母婴传播时 [11]，第二例发生在泰国一名未经治疗的原发性感染患者身上 [12]。泰国出现假阴性结果的原因是基于突变变化，因为使用修改后的引物和热循环参数进行扩增导致所有样本检测呈阳性。在最近的一项研究中，Weidner 及其同事 [13] 表明，80 个样本中有 4 个无法在前病毒 DNA PCR 中扩增，但这是由于样本的 DNA 含量低至 <8ng/μL。该研究还表明，对 20 个检测阴性的样本的特异性为 100% [13]。然而，已报告了几例假阳性病例 [14,15]。事实上，Buschet 等人报道过，未感染艾滋病病毒的个体中 HIV DNA PCR 假阳性率高达 18.5% [14]。
我们描述了一个 HIV 阳性病例，在无保护的异性性接触后长达 7 个月内，在两个时间点对 HIV 前病毒 DNA 进行检测时，该病例反复呈阴性。初始血清学分析结果不具结论性，在我们的环境中，此类不确定病例通常通过 HIV DNA PCR 进行确认。虽然提取后没有测量 DNA 量来确定 DNA 水平是否较低，但我们同时对已知的 HIV 阳性和阴性样本进行对照，以确保我们的 HIV 前病毒 DNA PCR 的有效性。这些对照是从我们实验室中已知的 HIV 阳性和阴性患者中收集的标准化样本，通常用作内部对照。在所有 PCR 中，内部对照都经过验证，测试样本连续呈阴性。考虑到这名女性的 HIV 前病毒 DNA PCR 呈阴性，并且她表示有过无保护的性接触，且血清学结果不确定，因此进行了其他补充测试。这些测试表明感染了 HIV-1 M 组 A 亚型。除主要的重组形式 (CRF)02_AG [16] 外，该亚型还已被证明在中非地区（包括加蓬和喀麦隆）传播。先前的一项研究未能诊断出美国一名婴儿的 HIV 亚型 C [11]。Cunningham 和同事在泰国对 E 亚型 CRF A/E 做出了类似的观察 [12]，这表明偶尔的突变（特别是非 B 亚型的突变）可能会导致前病毒 DNA 测试的假阴性或次优扩增。在本研究中，通过针对高度保守的 HIV-1 LTR 片段的 PCR 测试了前病毒 DNA。引物和探针之前已针对来自多个国家的不同病毒株（包括非 B 亚型）的 HIV RNA 定量进行了评估和优化。因此，这些修改后的引物和探针可以有效地对来自中非亚区（喀麦隆和中非共和国）的样本的 RNA 进行定量 [5]。
Cunningham 及其同事进一步表明，加入经过修改的引物对可能会改变这些假阴性结果 [12]。因此，一些引物对可能导致次优扩增，从而导致 DNA 水平低。已证明，可能由这些次优扩增导致的极低 DNA 水平是导致 HIV DNA PCR 假阴性结果的原因之一 [13]。我们的引物和探针已被证明在中非地区有效，该地区主要传播非 B 型 HIV 亚型，包括 A 型。虽然这项研究没有通过改变所用的引物来验证寡核苷酸引物错配，但需要注意的是，自 20
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