急性髓系白血病中新型PPP1R1B::STARD3融合转录本的检测：一例病例报告
抽象的
急性髓系白血病 (AML) 是儿童中第二常见的白血病类型。尽管 AML 患者的预后和诊断测试已经得到改善，但对 AML 新的可靠临床生物标记物的需求仍然很大。通读融合转录本 (RTFT) 是相邻基因的复杂转录本，其分子机制尚不清楚。这是首次报道 AML 患者中存在 PPP1R1B::STARD3 融合转录本。在这里，我们使用双端 RNA 测序 (RNA-seq) 研究了 AML 病例中 PPP1R1B::STARD3RTFT 的存在。
2019 年 9 月，一名 12 岁波斯男性因发烧、抽搐、出血和骨痛等症状被送往伊朗马什哈德谢赫医生医院。根据细胞形态和免疫表型特征，患者被诊断为 AML（非 M3-FAB 亚型）。使用 G 显带技术进行的染色体分析显示 t (9;22) (q34;q13)。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析表明PPP1R1B启动子可能是PPP1R1B::STARD3表达的原因。脂质代谢物水平的变化与癌症的发展有关，这种融合在癌细胞中的胆固醇运动中起着至关重要的作用。PPP1R1B::STARD3可能被视为胆固醇代谢和参与癌症发展和进展的PI3K/AKT信号通路靶向治疗的候选药物。
介绍
急性髓系白血病 (AML) 是一种髓系祖细胞恶性血液病，占儿童白血病的 15–20% [1]。这是一种复杂的遗传性疾病，有多个融合基因调节细胞增殖、分化和凋亡 [2]。融合基因是与这些融合位点相关的基因组和转录异常，可能导致肿瘤形成，并被用作 AML 患者的诊断、预后和治疗靶点 [3,4]。目前，有几种用于识别融合基因的技术，包括荧光原位杂交 (FISH)、全基因组测序 (WGS) 和转录组分析 [5,6]。使用 RNA 测序方法进行转录组分析是识别新的融合或嵌合（通过基因融合和反式剪接产生的转录本）转录本以进行 AML 诊断的最佳方法 [7,8,9]。 PPP1R1B::STARD3 是由两个相邻的前 mRNA 沿相同方向剪接而产生的嵌合转录本，且不存在染色体异常 [10,11,12]。研究表明，PPP1R1B::STARD3 在胃癌和乳腺癌患者中的频率分别约为 21.3% 和 8.3% [11,12]。该嵌合 RNA 是 PPP1R1B 和STARD3 基因在 chr17:q12 处相隔 455 bp 的基因之间发生通读事件的产物 [12]。融合位点通常位于 PPP1R1B 的外显子 6 和STARD3 的外显子 2 之间[11,12,13]。蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B (PPP1R1B) 是一种受多巴胺和 cAMP 调节的 32 kDa 磷蛋白 (DARPP-32)，在大脑中被发现，在大脑信号传导和生理过程中起关键作用。此外，截短的剪接异构体 t-DARPP 在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和胃癌的肿瘤细胞中表达 [12,14,15,16,17]。StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 (STARD3) 是类固醇生成急性调节相关脂质转移 (START) 蛋白家族的成员，在通过囊泡和非囊泡途径的脂质转移中起关键作用。由于脂质代谢在癌细胞中的重要性，这些代谢物表达的任何变化都可能导致癌症进展 [18]。 PPP1R1B::STARD3 的过度表达可能通过激活 PI3K/AKT 通路来增加癌细胞增殖和肿瘤发生 [12]。
本文通过转录组分析，在一名 12 岁的伊朗 AML 男孩体内发现了 PPP1R1B::STARD3 融合转录本，并通过 q-PCR 和 Sanger 测序证实了该融合转录本的存在，表明该融合转录本可能是 AML 中的一种新型生物标志物。此外，我们还利用公开的 scRNA-seq 表达矩阵数据，通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析，根据不同的 AML 细胞群和正常样本推断出 STARD3 和 PPP1R1B 亚克隆的表达模式。
病例介绍
2019 年 9 月，一名 12 岁波斯男性因发烧、抽搐、出血和骨痛等症状入住伊朗马什哈德谢赫医院。外周血检查确定白细胞 (WBC) 为 173.4 K/L，其中原始细胞为 86%，血红蛋白 (Hb) 为 10 g/dl，血小板为 19 × 10^9/L。骨髓穿刺显示在 75% 原始细胞存在下，细胞增多，成熟髓系细胞和巨核细胞数量明显减少。通过流式细胞仪（Attune NxT，ThermoFisher，美国）对骨髓样本进行免疫表型分析，并使用 FlowJo v7.6 软件（Tree Star，Ashland，OR）分析数据。这些细胞对 CD45（95%）、HLA-DR（76%）、CD33（41%）和 CD34（94%）标记呈阳性，而对 CD19（< 1%）、CD3（8%）、CD5（< 1%）、CD10（3%）、CD20（< 1%）、CD61（< 1%）、CD71（3%）和 CD117（< 1%）标记呈阴性。根据细胞形态和免疫表型特征，患者被诊断为 AML（非 M3-FAB 亚型）。骨髓评估显示，在所检查的 15 个细胞的 15 个中期中，染色体补体复合核型异常，9 号和 22 号染色体之间发生易位（t（9；22）（q34；q13））。患者接受了诱导化疗。然而，他在诊断后几个月去世了。
根据制造商的说明，使用 Tripure 试剂（Roche，德国曼海姆）从骨髓单核细胞 (BMMNC) 中提取总 RNA。使用带有 RiboErase (HMR) 的 KAPA HyperPrep 试剂盒制备 RNA-seq 文库，并在 NovaSeq 6000 平台 (Illumina)（CeGaT 公司，德国图宾根）上使用 1 亿个配对读数进行 RNA-seq。使用基于 Python 的工具 FusionCatcher 软件 v1.20 [19] 研究融合转录本，识别 PPP1R1B（NM_032192.4）和STARD3（NM_006804.4）转录本之间的通读融合转录本 (RTFT)。附加文件 1：表 S1 中提供了完整的融合列表。图 1A、B 显示了数据可视化软件包 Circos [20] 检测到的所有 234 个融合事件的概览，以及使用 R 中的 chimeraviz 包 v1.24.0 [21] 在 17 号染色体上定位参与 PPP1R1B::STARD3 融合的两个基因。为了进一步证实这一发现，我们分析了 35 个 AML 样本的 RNA 测序数据概况 (GSE142514)，并确定了 PPP1R1B::STARD3 融合 (2.8%)。FusionCatcher 识别的融合转录本完整列表可在附加文件 2：表 S2 中找到。使用深度学习技术 DEEPrior v2.0 [22] 评估融合的致癌性，以研究融合蛋白的氨基酸序列（附加文件 3：表 S3）。 64% 的融合预测 PPP1R1B::STARD3 具有致癌潜能，并使用 R 中的 ggplot2 包 v3.4.0 [23] 通过条形图描绘了排名靠前的候选融合的致癌概率（图 1C）。通过 RT-PCR 和 Sanger 测序验证了 PPP1R1B::STARD3 融合转录本（PPP1R1B 正向引物 5′-TCTGGATGAGTCCGAGAGAGA-3′ 和STARD3 反向引物 5′-GTCGAAGGTGACGAAGAGACA-3′）的检测（图 1D）。为了进一步了解 PPP1R1B::STARD3 融合的排他性，我们分析了 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）样本的两个 RNA-seq 数据谱（包括 GSE115525 和 PRJNA589314）。有趣的是，在先前的研究和RNA-seq数据中没有发现B-ALL患者中存在PPP1R1B::STARD3的报道。此外，通过从dbGap获得的三个AML和两个正常骨髓样本（phs000159）的scRNA-seq矩阵研究了PPP1R1B和STARD3的表达水平[24]。经过质量控制后，确定了35,000个AML细胞和6200个正常细胞进行进一步分析。对可变基因应用主成分分析（PCA），并应用均匀流形近似和投影（UMAP）算法进行降维和可视化（Seurat实现）（图2）。
图 1
A使用 FusionCatcher 绘制的急性髓系白血病病例中检测到的融合转录本的环形基因组景观。染色体内的融合转录本用蓝色链接表示，而染色体间的融合转录本用绿色丝带连接。蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B::StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 已用红色丝带标记。B蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B::StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 的融合图表明参与融合事件的两个伴侣基因在 17 号染色体上的位置。红色链接表示两个伴侣基因之间的断点，以及支持融合事件的测序读数数量。CDEEPrior 预测的不同候选融合的致癌概率的条形图。蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B::StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 的致癌性预测值为 64%。D 使用 RT-PCR 检测蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B::StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 融合转录本。泳道 1：大小标记（100 bp 梯子）；泳道 2：患者样本；泳道 3：阴性对照。对蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B::StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 融合转录本的 RT-PCR 分析显示琼脂糖凝胶上有 293 bp 的条带。Sanger 测序证实蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B 和 StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3 基因之间的融合
图 2
单细胞 RNA 测序数据可视化。单细胞 RNA 测序数据包括三个急性髓系白血病和两个正常样本中的 35,000 个急性髓系白血病细胞和 6200 个正常细胞。A 和 B 均匀流形近似和投影显示正常细胞和肿瘤细胞的合并单细胞转录组。C 和 D 分别为正常细胞和肿瘤细胞的蛋白磷酸酶 1 调节（抑制剂）亚基 1B 的表达。E 和 F 分别为正常细胞和肿瘤细胞的 StAR 相关脂质转移蛋白的表达
结果与讨论
在癌症中，两个或多个邻近基因共转录成单个 mRNA 的情况并不少见，这可能导致产生通读融合转录本 (RTFT) 并可能产生相应的融合蛋白。这些融合转录本可能包含来自两个相邻基因的部分或全部外显子，其中转录起始位点来自上游基因，终止位点来自下游基因 [25,26]。RTFT 通过上调下游基因导致致癌基因失调，从而导致各种类型癌症的发展 [27,28,29]。AML 患者 17 号染色体异常与预后不良和化疗耐药性有关 [30,31,32,33,34,35]。本研究通过 RNA-seq 分析，在一名伊朗 AML 患者中发现了 PPP1R1B::STARD3 这种新的融合转录本，并鉴定了 PPP1R1B::STARD3 融合转录本，并发现该融合断点位于与以往报道不同的位点。STARD3 在癌细胞胆固醇转移中起着关键作用，从而导致癌细胞增殖和发展。其异位表达可增加卵巢癌和乳腺癌的肿瘤侵袭性，表明其在癌症治疗中具有潜在作用 [36,37]。另一方面，PPP1R1B 参与胃和胰腺肿瘤发生 [17,30,38,39,40,41,42]。PPP1R1B 与 BCL-2 和钙调神经磷酸酶结合，通过降低肌醇 1,4,5-三磷酸受体 (InsP3R) 磷酸化，发挥 BCL-2 的抗凋亡功能 [14,43]。有证据表明，PPP1R1B::STARD3 的异常表达会通过 PI3K/AKT 信号通路显著增加细胞增殖 [12,18]。PI3K/AKT 通路失调与多种人类癌症有关，包括结直肠癌、乳腺癌和血液系统恶性肿瘤，这表明该通路在癌症治疗中具有治疗价值 [44,45]。UMAP 分析表明，与正常样本相比，AML 样本中表达 STARD3 的比例更高。然而，在正常或 AML 样本中均未检测到 PPP1R1B 的显著表达。结果表明，PPP1R1B::STARD3 融合转录本可能是由于 PPP1R1B 启动子的异常激活而表达的。 PPP1R1B::STARD3 在实体瘤（胃癌和乳腺癌）和白血病（而非 B-ALL）中的表达表明，该融合转录本可能通过 PI3K-AKT 通路在癌症发展中发挥重要作用。综合起来，我们的数据可能表明 PPP1R1B::STARD3 有助于肿瘤发生，并且可能是 AML 患者的预后标志物，具有开发治疗靶点的潜力。
结论
总之，我们的数据阐明了伊朗 AML 患者中首次报告的 PPP1R1B::STARD3 融合转录本，该转录本经 Sanger 测序证实，可能是 AML 诊断和治疗的重要靶点。这种融合可能成为 AML 的新潜在治疗生物标志物。然而，需要进一步分析以研究 PPP1R1B::STARD3 融合基因的致癌功能以及该融合转录本引起的下游分子事件。
数据和材料的可用性
原始 RNA 测序数据在 NCBI 中以以下 ID SRR18012668 公开提供，并且 PPP1R1B::STARD3 融合转录断点已存放在 NCBI 的 GenBank 中，登录号为 OL695927。
缩写
急性髓系白血病
通读融合转录本
荧光原位杂交
全基因组测序
蛋白磷酸酶 1 调节（抑制）亚基 1B
多巴胺和 cAMP 调节磷蛋白 32 kDa
StAR 相关脂质转移蛋白结构域 3
类固醇生成急性调节相关脂质转移
单细胞 RNA 测序
白细胞
血红蛋白
骨髓单个核细胞
主成分分析
均匀流形近似与投影
B细胞急性淋巴细胞白血病
肌醇 1,4,5-三磷酸受体
参考
Hunger SP、Teachey DT、Grupp S、Aplenc R。儿童白血病。收录于：Abeloff 临床肿瘤学。第六版。Elsevier Inc.；2019 年。第 1748–1764.e4 页。
De Kouchkovsky I, Abdul-Hay M. 急性髓系白血病：全面回顾及2016年更新。《Blood Cancer J.》2016;6(7):e441。
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